Приложение №1.

И н с т р у к ц и я по проведению лабораторной работы.

Лабораторная работа №3

Тема:

Цель: сформировать знания о роли ферментов в клетках; выяснить ферментативные свойства белков-пероксидаз; закрепить умение работать с микроскопом; проводить опыты и объяснять результаты работы.

Оборудование: свежий 3%-ный раствор пероксида водорода, пробирки, пинцет, ткани растений (кусочки сырого и варёного картофеля) и животных (кусочки сырого и варёного мяса), песок, ступка и пестик.

Дополнительные сведения: пероксид водорода образуется в клетке в процессе обмена веществ, обладает мутагенным действием. Н2О2 - вещество химически нестойкое и способно самопроизвольно разлагаться с образованием устойчивых соединений: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2

Х о д р а б о т ы.

1. Приготовьте четыре пробирки со свежим 3%-ный раствором пероксида водорода, затем поместите в первую пробирку кусочек сырого картофеля, во вторую – кусочек варёного картофеля, в третью – кусочек сырого мяса, в четвёртую – кусочек варёного мяса. Пронаблюдайте, что будет происходить в каждой пробирке.

2. Составьте таблицу, показывающую активность каждой ткани при различной обработке.

3. Измельчите в ступке кусочек сырого картофеля с небольшим количеством песка. Перенесите измельчённый картофель вместе с песком в пробирку и капните туда немного пероксида водорода. Сравните активность измельчённой и целой растительной ткани.

4. Объясните полученные результаты.

Ответьте на вопросы:

Как проявляется активность ферментов в живых и мёртвых тканях?

Различается ли активность ферментов в растительных и животных тканях?

Как влияет измельчение ткани на активность фермента?

Как бы вы предложили измерить скорость разложения пероксида водорода?

Как вы считаете, все ли живые организмы содержат фермент пероксидазу,

обеспечивающий разложение пероксида водорода?

Образец отчёта по лабораторной работе

«Каталитическая активность ферментов в живых тканях»

Что делали?	Что наблюдали?
1. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек сырого картофеля.		В клетках картофеля присутствуют ферменты, ускоряющие расщепление Н2О2: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2
2. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек варёного картофеля.		Ферменты утратили свои каталитические свойства: при варке от нагревания произошла денатурация белков.
3. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек сырого мяса.	Бурное выделение пузырьков кислорода.	В клетках мышечной ткани животного есть ферменты, ускоряющие расщепление Н2О2: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2
4. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек варёного мяса.	Изменений с раствором не происходит. Признаков разложения Н2О2 нет.	При варке ферменты потеряли свою каталитическую активность вследствие денатурации белковых молекул.
5. В пробирку с раствором Н2О2 положили кусочек измельчённого сырого картофеля.	Выделение пузырьков кислорода стало более интенсивным чем до измельчения.	При измельчении клеток картофеля количество ферменты, ускоряющие расщепление Н2О2 увеличилось, поэтому скорость реакции стала больше: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2

Вывод: действие ферментов-пероксидаз сходно в растительных и животных клетках, общность физиологических процессов – одно из доказательств родственных связей между растительными и животными организмами.

Лабораторная работа № 1

Тема: Каталитическая активность ферментов в живых клетках

Цель: выявить каталитическую функцию белков в живых клетках, сформировать знания о роли ферментов в клетках, закрепить умение работать с микроскопом, проводить опыты и объяснять результаты работы. Оборудование: сырой и варёный картофель, лист элодеи (другого растения), свежий 3% -ный раствор пероксида водорода, пробирки, пинцет, песок, ступка и пестик, тетрадь, ручка, простой карандаш, линейка.

Ход работы:

Приготовьте двепробирок, и поместите в первую немного песка, во вторую - кусочек сырого картофеля, в третью – кусочек варёного картофеля Капните в каждую из пробирок немного пероксида водорода. Пронаблюдайте, что будет происходить в каждой из пробирок.

Измельчите в ступке кусочек сырого картофеля с небольшим количеством песка.

Перенесите измельчённый картофель вместе с песком в пробирку и капните немного пероксида водорода.

Сравните активность измельчённой и целой растительной ткани.

Составьте таблицу, показывающую активность каждой ткани при различной обработке. Объясните полученные результаты. Ответьте на вопросы:

Наблюдения

Перекись водорода и сырой картофель

Выделяется кислород, белок распадается до первичной структуры и превращается в пену

Перекись водорода и вареный картофель

Реакции нет

Ответьте на вопросы: В каких пробирках проявилась активность фермента каталазы? Объясните, почему.

Каталаза фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: Н2О2 + Н2О2 = О2 + 2Н2О. Биологическая роль К. заключается в деградации перекиси водорода, образующейся в клетках в результате действия ряда флавопротеиновых оксидаз (ксантиноксидазы, глюкозооксидазы, моноаминоксидазы и др.), и обеспечении эффективной защиты клеточных структур от разрушения под действием перекиси водорода. Генетически обусловленная недостаточность К. является одной из причин так называемой акаталазии - наследственного заболевания, клинически проявляющегося изъязвлением слизистой оболочки носа и ротовой полости, иногда резко выраженными атрофическими изменениями альвеолярных перегородок и выпадением зубов. Активность проявилась в 1,3 пробирках, т.к. в них были сырые продукты, содержащие белки. А в остальных пробирках были продукты с разрушенным в процессе варки белком и реакция не проявилась. Поэтому организмом лучше усваиваются продукты, содержащие белок.

Как проявляется активность фермента в живых и мёртвых тканях? Объясните наблюдаемое явление. В мертвых тканях активность ферментов отсутствует, т.к. белок в них был разрушен при варке. А в живых тканях при взаимодействии с перекисью водорода выделялся кислород, а белок расщепляясь до первичной структуры превращался в пену.

Как влияет измельчение ткани на активность фермента в живых тканях растений и животных? При измельчении живой ткани реакция проходит быстрее, т.к. площадь соприкосновения белка и перекиси водорода увеличивается Как бы вы предложили измерить скорость разложения пероксида водорода? v=kc(a)c(b) где v является скоростью химической реакции k – константа скорости с – изменение концентрации Как вы считаете, все ли живые организмы содержат фермент каталазу, обеспечивающий разложение пероксида водорода?

Ответ обоснуйте. Так как это фермент класса оксидоредуктаз, то он катализирует разложение токсичного для живых клеток пероксида водорода на воду и кислород. Содержится в лизосомах. Можно сделать вывод, что содержится во всех клетках живых организмов. Объясните свои наблюдения. Сформулируйте вывод.

Вывод: белок содержится только в живых продуктах, а в варенных продуктах белок разрушен, поэтому никакой реакции с ними не происходит. Если же измельчить продукты, то реакция будет проходить быстрее.

Введение

Настоящее пособие предназначено для ознакомления студентов как с классическими методами исследования ферментов, так и с современными, высокочувствительными аналитическими методами, использующими ферменты как инструменты исследований. Пособие состоит из пяти разделов:

1. Методы определения активности ферментов.

2. Изучение кинетических параметров ферментативных реакций.

3. Методы выделения и очистки ферментов.

4. Изучение субклеточной локализации ферментов.

5. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов.

Все разделы «Практикума» имеют самостоятельные задачи, однако требования, предъявляемые к студентам, остаются одинаковыми. Каждая предлагаемая работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении любой из них студент должен самостоятельно подготовить все нужные растворы, освоить необходимые методы исследования, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками.

Уровень используемых методических приемов соответствует требованиям современной науки. При необходимости в описании работы приводятся краткие теоретические сведения. Все работы, включенные в «Практикум», неоднократно выполнялись студентами.

Работа 1. Титрометрическое определение активности каталазы

Оборудование и реактивы: кипящая водяная баня; пипетки на 5, 10, 20 и 25 мл; цилиндры измерительные с носиком на 10 и 25 мл; колба мерная на 100 мл; колбы конические на 200 мл; ступка с пестиком фарфоровые; перманганат калия (0,1 н); серная кислота (10 %); карбонат натрия; пероксид водорода (0,1 н); свежий растительный материал (картофель или морковь).

2 г сырого картофеля (или моркови) растирают в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат натрия до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до объема 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30 минут, после чего ее фильтруют. Далее определяют активность по схеме (2 опытных пробы и 2 контрольных):

Опыт и контроль титруют 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин бледно-розового окрашивания). Отмечают количество раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося (после ферментативного разложения) пероксида водорода в опытной колбе и на титрование всего пероксида водорода в контрольной. По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.

Расчет ведут в соответствии с уравнением реакции:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 > 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,

согласно которому 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.

Пример расчета: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной 30,2 мл 0,1 н раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2 - 15,5) 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7 1,7) 24,99 мг. Значит, в 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное разложить = 99, 96 мг пероксида водорода, а за 1 мин - (99,96:30) 3,33 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (3,33:0,034) 100 Е каталазы.

1. Рассчитайте содержание каталазы в исследуемом материале.

2. Напишите систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой)

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н 2 О 2 ) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2Н 2 О 2 → О 2 + 2Н 2 О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы : 1) 1% раствор Н 2 О 2 ; 2) 10% раствор серной кислоты ; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление : в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета : моль-эквивалент Н 2 О 2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н 2 О 2 ; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н 2 О 2 , которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы : каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

Показатель каталазы составляет 2-3х10 -:6 , в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н 2 О 2 (2 Н 2 О 2 → 2 Н 2 О + О 2 ) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н 2 О 2 ; 2) 4 % раствор молибдата аммония.

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37 ° С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Е оп и Е хол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,210 3 – коэффициент экстинкции, ммоль –1 см –1 .

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6 + 0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.

Каталаза – очень распространенный дыхательный фермент, присутствующий практически в любом биологическом материале растений и животных.

В процессе дыхания в качестве побочного продукта окисления веществ образуется перекись водорода, оказывающая в высоких концентрациях токсичное действие на цитоплазму. Обезвреживание перекиси происходит при участии фермента каталазы (одна из его функций), разлагающей ее на воду и молекулярный кислород по уравнению:

каталаза

2 Н2О2 2Н2О +О2

Об активности каталазы судят по объему кислорода, выделяющегося в результате разложения перекиси водорода.

Для определения пользуются прибором, который состоит из каталазника, бюретки емкостью 50 мл и стеклянной груши, соединенных каучуковыми трубками и стеклянным тройником, каучуковая трубка на конце тройника снабжена винтовым замком. Бюретка и стеклянная груша закреплены на штативе. Их заполняют дистиллированной водой до половины объема.

ХОД РАБОТЫ

0,5 г листьев растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком и добавляют 0,5 г мела для создания щелочной реакции (рН=7,7 оптимальная для данного фермента).

Во время растирания вливают небольшими порциями 20 мл воды, смесь вносят в одно колено каталазника. В другое колено помещают 5 мл 3%-ной перекиси водорода. Каталазник соединяют с каучуковой трубкой, не допуская смешивания жидкостей.

Открывают зажим и перемещением воронки устанавливают уровень воды в бюретке на нуле. Закрывают зажим и быстрым изменением положения каталазника смешивают жидкость в обоих коленах. Затем все время потряхивая каталазник по снижению уровня воды в бюретке отмечают объем кислорода в мл, выделенного в течении 3 минут на 1 г массы сырого материала.

Во время опыта каталазник нельзя держать всей ладонью, так как при нагревании от руки воздух в колбе расширяется, что может повлиять на точность отсчета. При отсчете вода в круглой воронке и бюретке должна быть на одном уровне.

Определяют активность каталазы в листьях верхнего и нижнего ярусов. Можно использовать также проростки различных сортов сельскохозяйственных культур, различающихся по скороспелости к неблагоприятным воздействиям.

Результаты опыта заносят в таблицу:

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) растение с несколькими ярусами листьев, проростки пшеницы или другой культуры; 2) промытый речной песок; 3) порошок мела; 4) 3%-ный раствор перекиси водорода; 5) фарфоровые ступки с пестиком; 6) мерные цилиндры на 25 мл; 7) прибор для определения каталазы; 8) часы; 9) весы с разновесами.