Строение генома бактерий. Мобильные генетические элементы. транспозиции в геномах плазмид, бактерий Интегроны - природные системы клонирования и экспрессии

Высших организмов, открыты онкогены и т.п. (см. Мигрирующие генетические элементы). 

    IS-ЭЛЕМЕНТЫ И ТРАНСПОЗОНЫ БАКТЕРИЙ 

Транспозоны вместе с плазмидами и фагами (в к-рые они легко интегрируются) способны осуществлять обмен разл, заключенных в них генов между весьма отдаленными видами бактерий , поэтому они играют чрезвычайно важную роль в эволюции бактерий , включая адаптацию их к лек. в-вам и продуцирования ими новых токсинов. 

Транспозоны и 15-элементы ответственны за целый ряд генетических явлений у бактерий. Встраивание мобильного элемента в какой-либо ген может привести к его инактивации. Кроме того, некоторые IS-элементы и транспозоны вызывают генетическую нестабильность поблизости от места своей локализации в окрестностях элемента заметно повышается частота делеций и инверсий, причем одна из границ перестройки всегда совпадает с одним из концов 15-элемента , автономного или в составе транспозона. Мобильные элементы способны вызывать также транслокации. Действительно, два расположенных на некотором расстоянии друг от друга IS-эле-мента можно рассматривать как транспозон и такие транспозоны действительно способны к перемещению как одно целое, хотя по крайней мере для некоторых IS-элементов показано, что частота перемещения такой составной структуры быстро падает с увеличением расстояния между фланкирующими IS-элементами. 

Подобные парадоксы. можно разрешить, вспо.мнив, что и плазмиды и мобильные генетические элементы обладают сравнительной автономией от основной массы генетического материала , и поэто .му их можно рассматривать как своего рода организмы, обитающие в особой, генетической, среде. Таким образом, можно рассматривать функции плазмид , IS-элементов и транспозонов не с точки зрения преимуществ, которые они несут бактериям-хозяевам, а с точки зрения их самоподдержания в бактериальных популяциях, другими словами, можно считать автономные элементы прокариот эгоистической ДНК, обеспечивающей в первую очередь собственное размножение. В этом смысле. мобильные элементы и плазмиды непосредственно примыкают к вирусам, эгоистические тенденции которых очевидны. 

    Какие же гены оказываются полезными и входят в состав мобильных элементов Это не праздный вопрос, поскольку каждая бактериальная клетка хорошо приспособлена к своей среде обитания и не нуждается в генах, аналогичных тем, которые у нее уже есть и обеспечивают ее адаптацию к среде. С другой стороны, приспособление к совершенно новой среде обитания , по-видимому, требует относительно значительной перестройки генетического материала клетки, включающей, в частности, коадаптацию многих разных генов. Поэтому клетка может получить селективное преимущество за счет приобретения какого-либо гена (в составе транспозона) лишь в том случае, если этот ген сам по себе способен оказаться выгодным для бактерии в определенных условиях, т. е. именно такие гены выгодно иметь транспозонам в своем составе. Действительно, на транспозонах путешествуют гены устойчивости к различным бактериальным ядам, в том числе к тяжелым металлам и антибиотикам, гены дополнительных метаболических путей , позволяющие использовать, например, какой-нибудь необычный , наконец гены некоторых токсинов, делающие бактерии патогенными и позволяющие им тем самым существенно изменить образ жизни. 

Рис. 15.13. Выявление транспозонов путем электронно-микроскопического исследования гетеродуплексов . Для того чтобы сделать транспозон видимым, нагревают ДНК из бактерии дикого типа (В) и бактерия, несущей транспозон (А), и в результате цепи двойных спиралей расходятся (плавление). При последующем медленном охлаждении смеси происходит спаривание комплементарных оснований отдельных цепей ДНК А и В, что ведет к образованию гетеродуплексов ДНК. Если на концах транспозона имеются противоположно ориентированные комплементарные IS-элементы, то эти области тоже спариваются и образуют стебелек , на котором средняя часть транспозона выступает вбок в виде петли из одиночной цепи.

    Хотя, как мы убедились, многие свойства мобильных эле.ментов и плазмид разумно рассматривать с точки зрения концепции эгоистичной ДНК, они играют существенную позитивную роль в жизни бактерий-хозяев, даже если не приносят непосредственной пользы. Дело в том, что IS-элементы, транспозоны и плазмиды служат важнейшими факторами генетической изменчивости и эволюции бактерий. 

Транспозоны бактерий обладают сходной структурной организацией (рис. 2.1). Все они ограничены концевыми инвертированными повторами, протяженность и состав которых различны у разных транспозонов (от десятка до нескольких сотен п.н.). Однако у определенного транспозона они представляют собой своеобразные константы, т. е. не изменяются при его внедрении в разные сайты. Характерной чертой транспозонов бактерий является и тот факт, что с обоих концов они ограничены прямыми повторами реципиентной ДНК (ДНК-мишени). Протяженность этих повторов варьирует от 5 до 9 п.н., но для конкретного элемента она постоянна . Последовательность же нуклеотидов в повторах определяется местом локализации элемента . В сайтах независимого происхождения транспозон фланкирован повторами различного состава. 

Мутации, вызываемые транспозонами. В генетике бактерий все большее значение приобретает метод получения мутаций с помопдью транс-позонов. Транспозоны (Тп) представляют собой короткие двойные цепи ДНК, которые состоят из более чем 2000 пар оснований и обычно обусловливают устойчивость к одному антибиотику, в исключительных случаях-к нескольким, Транспозоны способны перепрыгивать из одного участка генома в другой, в частности из бактериальной хромосомы в плазмиду и обратно таким образом, они могут включаться в различные участки генома (см. разд. 15.3,1), В случае внедрения транспозо-на в какой-либо структурный ген хромосомы нуклеотидная последовательность этого гена будет нарушена и генетическая информация не сможет транслироваться в функционально полноценный полипептид. ВЬзникнет инсерционный мутант. 

Выше упоминалось, что мобильные элементы вызывают генетическую нестабильность поблизости от участка своей локализации. Эта особенность легко объясняется уже известными нам свойствами IS-элементов и транспозонов бактерий, На рис. 80 показано, что получится при перемещении в пределах одного репликона транспозона типа ТпЗ, т.е. с репликативным механизмом транспозиции . В зависимости от того, как внесены разрывы в ДНК-мишень, получится либо делеция , либо инверсия генетического материала между местом расположения транспозона и мишенью его перемещения. По-сути дела, образование делеции напоминает процесс распада коинтеграта , но поскольку одна из образовавшихся молекул ДНК не имеет ориджина репликации , она утрачивается. Если происходит инверсия, то на обеих ее границах оказывается по копии транспозона в инвертированной друг относительно друга ориентации. Таким образом, образование делеций и инверсий характерно для репликативг ного механизма транспозиций. 

Ключевым свойством бактериальных мобильных элементов , обеспечивающим их сохранение, является их способность перемещаться с репликона на репликон . Наличие у бактерий трансмиссивных и мобилизуемых плазмид позволяет транспозонам и IS-элементам не только переходить с плазмиды на плазмиду или из хромосомы на плазмиду, но и путешествовать из клетки в клетку в составе плазмид . Таким путем мобильные элементы могут распространяться в бактериальных популяциях, даже если не приносят своим хозяевам никаких преимуществ. В этой связи следует упомянуть о явлении иммунности к транспозиции многие транспозоны и IS-элементы значительно чаще перемещаются на новые репликоны, чем на новое место в составе того репликона, в котором они находятся. Молекулярный механизм этого свойства еще не выяснен, но очевидно, что оно способствует распространению мобильного элемента по максимальному количеству репликонов. 

Одинаковые IS-элементы и транспозоны, расположенные на разных репликонах, способны обеспечивать гомологичную рекомбинацию , приводящую к образованию коинтеграта . Именно таким путем некоторые плазмиды обратимо встраиваются в хромосому бактерий, что сразу обеспечивает добавление значительного фрагмента генетического материала (рис. 82). Плазмиды, способные встраиваться в хромосому бактерий и вырезаться оттуда, называют эписомами. Иногда вырезание эписомы может происходить не по той паре IS-элементов , по которой прошла интеграция . В этом случае плазмида может захватить часть хромосомного материала, а часть своей ДНК 

Плазмиду, несущую модифицированный транспозон Тп5 со встроенным геном токсина, ввели в бактерию, в хромосомную ДНК которой был встроен транспозон Тп5 дикого типа. 

У многих бактерий обнаружены нехромосомные генетические элементы плазмиды, умеренные фаги и мигрирующие элементы (транспозоны и 15-элементы). Для плазмид характерно стабильное существование в нехромосомном состоянии. Транспозоны и 15-элементы входят, как правило, в состав хромосом, но способны переходить из хромосомы в плазмиду, поэтому также могут быть отнесены к нехромосомным генетическим элементам. 

Транспозоны могут служить маркером гена, предназначенного для клонирования. Как известно, при клонировании хромосомных генов бактерий иногда возникают сложности, связанные с тем, что нет простого метода , позволяющего выявить, какая из плазмид , несущих встроенный фрагмент хромосомной ДНК, содержит интересующий исследователя ген. Иногда эту проблему удается решить, выделив сначала мутант по этому гену с включенным в него или расположенным поблизости транспозоном. 

В хромосомных ДНК прокариотических и эзгкариотических клеток имеются также контролирующие или так называемые "прыгающие" подвижные гены - транспозоны (Тп), впервые открытые Б Мак-Клинток в 1940 г у кукурузы Они находятся на значительном расстоянии от других генов, на которые оказывают влияние Благодаря мутациям, названным "транспозонными взрывами", возможно массовое и в известной мере направленное перемещение генетических элементов Транспозоны способны реплицироваться и внедряться (инсерция) в виде одной из копий в новое место генома (ДНК ядра) У бактерий преобладающая часть транспозонов кодирует фермент

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_1.jpg" alt=">МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ. ТРАНСПОЗИЦИИ">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_2.jpg" alt=">В геномах плазмид, бактерий и эукариот широко распространены особые генетические элементы, способные перемещаться из"> В геномах плазмид, бактерий и эукариот широко распространены особые генетические элементы, способные перемещаться из одного участка генома в другой, - мобильные элементы. Разнообразные рекомбинационные процессы, лежащие в основе перемещений мобильных элементов, объединены под общим названием «транспозиции». Транспозиции осуществляются особыми белками, гены которых, в основном, локализованы в самих мобильных элементах. Гомология между мобильным элементом и последовательностью ДНК, в которую он перемещается (ДНК-мишень), как правило, отсутствует. Встраивание элементов, как правило, происходит в случайные сайты ДНК-мишени. Для мобильных элементов характерно пребывание в составе хромосом или плазмид.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_3.jpg" alt=">В большинстве своем мобильные элементы прокариот и эукариот построены по сходному плану. Сами элементы"> В большинстве своем мобильные элементы прокариот и эукариот построены по сходному плану. Сами элементы состоят из центральной части, фланкированной инвертированными повторами (ИП). Центральная часть обычно содержит ген (или гены), кодирующие белки транспозиции. Главный белок транспозиции – транспозаза. У ретроэлементов с длинными концевыми повторами энзим, соответствующий транспозазе, называют интегразой. Группа мобильных элементов бактерий содержит в центральной части также гены, не имеющие отношения к транспозиции, чаще всего это факторы устойчивости к антибиотикам, лекарственным веществам или ядам. Такие элементы при их открытии получили название транспозонов (Tn). Позднее так стали называть все мобильные элементы. Далее мы тоже будем называть все мобильные элементы транспозонами. Некоторые бактериальные транспозоны имеют на концах длинные ИП, в свою очередь являющиеся мобильными IS-элементами. В этих случаях центральная часть транспозона содержит только посторонние гены, а гены транспозиции находятся в IS-элементах, причем один из них, инактивирован одной или более мутациями.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_4.jpg" alt=">Основные типы мобильных элементов">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_5.jpg" alt=">ИП абсолютно необходимы для транспозиции, поскольку именно их концы связываются транспозазой, и по ним"> ИП абсолютно необходимы для транспозиции, поскольку именно их концы связываются транспозазой, и по ним происходит рекомбинация. Отдельная группа ретротранспозонов не содержит никаких концевых повторов. Все мобильные элементы, кроме последней группы, на обоих концах фланкированы дуплицированными прямыми повторами (ДПП) из нескольких нуклеотидов ДНК-мишени. Состав этих нуклеотидов варьирует, так как мобильные элементы внедряются в случайные сайты ДНК-мишени, но их число постоянно для каждого элемента. Чаще всего оно равно 5. Таковы общие представления о структуре мобильных элементов. Далее отдельно рассмотрим мобильные элементы прокариот и эукариот.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_6.jpg" alt=">Структура мобильных элементов определяет механизмы их перемещений. Хотя эти механизмы различаются в деталях, имеется"> Структура мобильных элементов определяет механизмы их перемещений. Хотя эти механизмы различаются в деталях, имеется общий принцип реакций транспозиции. Процесс происходит в 3 этапа. На первом этапе 2 молекулы транспозазы соединяются с концами подвижного элемента, сводят концы вместе и генерирует в них разрывы, чаще всего в обеих цепях. Затем транспозаза делает в обеих цепях ДНК-мишени ступенчатые разрывы, отстоящие друг от друга на столько пар нуклеотидов, сколько обнаруживается в ДПП данного элемента. Второй этап – обмен цепями, приводящий к рекомбинации между ДНК оставляя, за счет ступенчатости разрывов, бреши между 5"-P-концами элемента и 3"-OH-концами мишени. Катализируемое транспозазой расщепление и замыкание концов цепей ДНК происходит без потери энергии связей и не требует АТФ, что напоминает консервативную сайт-специфическую рекомбинацию. Отличие от последней заключается в том, что транспозаза не образует ковалентной связи с 5’-P концом ДНК. На третьем этапе происходит репаративный синтез брешей, формирующий ДПП, а иногда еще и репликация элемента. Таков общий общий механизм транспозиционной рекомбинации. Различные конкретные механизмы транспозиций рассмотрим одновременно с описанием различных классов мобильных элементов.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_7.jpg" alt=">репликативная транспозиция нерепликативная транспозиция Схема, демонстрирующая общий принцип реакций транспозиции">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_8.jpg" alt=">МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ПРОКАРИОТ: IS-элементы, транспозоны Для бактерий и плазмид характерны мобильные элементы"> МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ПРОКАРИОТ: IS-элементы, транспозоны Для бактерий и плазмид характерны мобильные элементы с короткими или длинными ИП. Длина ДПП, как правило, 5 или 9 п.н. Бактериальные мобильные элементы можно разделить на две основные группы: 1. IS-элементы: небольшие (размером не более 2,5 т.п.н.) элементы, которые состоят из центральной части с геном транспозазы, фланкированной двумя инвертированными повторами. 2. Собственно транспозоны, которые несут, кроме транспозазы, другие гены, не имеющие отношения к транспозиции (чаще всего гены устойчивости к антибиотикам). Собственно транспозоны можно в свою очередь разделить на следующие группы 1) Сложные транспозоны (семейство Tn3) – короткие ИП на концах, делают в ДНК-мишени ДПП из 5 п.н. и перемещаются по механизму репликативной транспозиции. 2) Составные транспозоны (Tn5, Tn9, Tn10) с длинными ИП, представляющими собой различные IS-элементы. Длина ДПП обычно 9 п.н. Примеры прокариотических мобильных элементов приведены в следующей ниже таблице.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_9.jpg" alt=">Структура мобильных элементов прокариот Общая схема структуры мобильных элементов прокариот">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_10.jpg" alt=">Теперь рассмотрим детали. Основные механизмы транспозиций изображены на рисунках, следующих ниже. Репликативная транспозиция"> Теперь рассмотрим детали. Основные механизмы транспозиций изображены на рисунках, следующих ниже. Репликативная транспозиция отличается тем, что мобильный элемент, перемещаясь в другую молекулу, оставляет свою копию в исходной ДНК. Это может произойти только за счет удвоения (репликации) элемента. При репликативной транспозиции на концах подвижного элемента происходят разрывы с образованием выступающих 3’-OH-концов. Одновременно транспозаза делает разрывы в ДНК-мишени. 3’-OH-концы подвижного элемента ковалентно связываются с 5’-Р-концами мишени, и образуется структура с двумя вилками репликации на концах подвижного элемента. В вилках репликации инициируется синтез ДНК (направленный «внутрь»). В результате образуется две копии мобильного элемента. При этом репликоны, содержащие «старую» и «новую» копию мобильного элемента сливаются (образуется коинтеграт). Коинтеграты разрешаются (разрезаются) на 2 репликона в рекомбинационном res-сайте ферментом резолвазой. Старая и новая копии мобильного элемента в коинтеграте находятся в одной ориентации, и разрешение коинтеграта идет через сложную фигуру, напоминающую восьмерку. В результате снова образуется 2 репликона, но теперь каждый из них несет копию мобильного элемента. Реакция относится к сайт-специфической рекомбинации. Репликативный механизм транспозиции распространен сравнительно мало. Он обнаружен у мобильного элемента Is6, фага Mu и бактериальных транспозонов семейства Tn3 с короткими ИП.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_11.jpg" alt=">Структура транспозона Tn3">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_12.jpg" alt=">">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_13.jpg" alt=">Транспозон Tn3 представляет семейство мобильных элементов с короткими ИП (35-50 п.н.), перемещающимися с помощью"> Транспозон Tn3 представляет семейство мобильных элементов с короткими ИП (35-50 п.н.), перемещающимися с помощью репликативной транспозиции и образующими ДПП из 5 п.н. У самого Tn3 центральная часть содержит гены транспозазы, резолвазы и бета-лактамазы bla (обеспечивает устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда). Ген транспозазы tnA кодирует большой белок из примерно 1000 а.о., ген резолвазы tnR кодирует белок из 185 а.о. Гены транспозазы и резолвазы транскрибируются в противоположных направлениях с промоторов, расположенных в межгенном пространстве длиной 170 п.н. В межгенном пространстве находится и сайт res, по которому происходит разрешение коинтегратов. Транскрипции генов резолвазы и транспозазы конкурируют друг с другом, и ген резолвазы выступает как ген-регулятор гена транспозазы. К семейству Tn3 относятся Tn1, Tn1000 и др.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_14.jpg" alt=">Большинство прокариотических мобильных элементов перемещается с помощью нерепликативной транспозиции. Нерепликативная транспозиция заключается в"> Большинство прокариотических мобильных элементов перемещается с помощью нерепликативной транспозиции. Нерепликативная транспозиция заключается в вырезании элемента и его перемещении в новое место. При этом 2 молекулы транспозазы связываются с концами мобильного элемента и делают разрывы одновременно в обеих цепях ДНК на концах мобильного элемента и в ДНК-мишени. Далее транспозаза сводит вместе концы мобильного элемента и ДНК-мишень, 3-OH-концы элемента соединяются с 5-Р-концами ДНК-мишени, а между 3’-OH-концами ДНК-мишени и 5’-Р- концами элемента образуется брешь, которая заполняется с помощью репаративного синтеза ДНК, в результате чего на концах мобильного элемента возникают ДПП строго фиксированной длины. В исходном репликоне остается ДНР. Будет ли он репарирован – зависит хозяйской клетки. Этот механизм характерен для большинства мобильных элементов бактерий и эукариотических элементов с короткими ИП. По такому типу перемещаются многие IS-элементы и мобильные элементы, которые называют составными: Tn5, Tn9, Tn10 и другие. Составные транспозоны отличаются тем, что у них инвертированные повторы представлены IS-элементами, которые находятся в обратной или (гораздо реже, например, Tn9) в прямой ориентации.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_15.jpg" alt=">МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ЭУКАРИОТ Мобильные элементы эукариот значительно разнообразнее прокариотических элементов. У эукариот распространены"> МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ЭУКАРИОТ Мобильные элементы эукариот значительно разнообразнее прокариотических элементов. У эукариот распространены разнообразные мобильные элементы как прокариотического типа, так и элементы, встречающиеся только у эукариот, – ретроэлементы или ретротранспозоны. Элементы прокариотического типа с короткими ИП (класс II.1) характерны для растений и дрозофилы. Элементы с длинными ИП (класс II.2) у эукариот встречаются редко. Элементы с короткими ИП (класс II.1) содержат транспозазу и перемещаются путем нерепликативной транспозии, но отличаются прокариотических мобильных элементов некоторыми особенностями, специфичными для эукариотических элементов, например, наличием у многих из них интронов. ДНК-транспозоны эукариот делают ДПП различной длины, специфичной для каждого элемента.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_16.jpg" alt=">Примерами мобильных элементов класса II.1 у дрозофилы являются элементы Р и hobo. Р-элемент содержится"> Примерами мобильных элементов класса II.1 у дрозофилы являются элементы Р и hobo. Р-элемент содержится в количестве 30-50 копий на геном. Его размер примерно 3 т.п.н., ИП из 31 п.н., ДПП – 8 п.н. Ген транспозазы в центральной части элемента содержит 3 интрона и 4 экзона и экспрессируется с использованием альтернативного сплайсинга. В соматических клетках из первых трех экзонов формируется укороченная мРНК, с нее транслируется полипептид размером 66 kDa, который является репрессором транспозазы. В генеративных клетках образуется полноразмерный транскрипт из 4 экзонов и, соответственно, полноразмерный белок – транспозаза. Таким образом, транспозиция Р-элемента происходит только в клетках зародышевой линии.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_17.jpg" alt=">К этому же типу транспозонов относятся многие мобильные элементы растений: элементы Spm кукурузы, Tgm1"> К этому же типу транспозонов относятся многие мобильные элементы растений: элементы Spm кукурузы, Tgm1 сои, Tam1 и Tam2 львиного зева и др. Отметим двухкомпонентную систему Ac/Ds кукурузы (это самый первый обнаруженный мобильный элемент, описанную Барбарой Мак-Клинток): она включает автономно транспозирующийся элемент Ас (4565 п.н., ИП из 11 п.н., ДПП из 8 п.н., ген транспозазы содержит 4 интрона) и гетерогенные по длине элементы Ds, которые являются делетированными производными Ас-элемента и перемещаются с помощью его транспозазы.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_18.jpg" alt=">Классификация эукариотических мобильных элементов">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_19.jpg" alt=">">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_20.jpg" alt=">У эукариот широко распространены ретротранспозоны, в транспозициях которых задействованы фермент обратная транскриптаза (ревертаза) и"> У эукариот широко распространены ретротранспозоны, в транспозициях которых задействованы фермент обратная транскриптаза (ревертаза) и РНК-копия элемента в качестве интермедиата. Ретроэлементы подразделяются на 2 группы: Ретротранспозоны с длинными прямыми концевыми повторами (ДКП) (класс I.1). Их структура соответствует ДНК-копиям геномов ретровирусов позвоночных, которые также являются мобильными элементами. Ретроэлементы (класс I.2), не содержащие повторов на концах (некоторые авторы используют для них название «ретропозоны»).

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_21.jpg" alt=">Ретровирусы являются «прототипами» ретротранспозонов. Их цикл развития состоит из чередования РНК- и ДНК-стадий. Вирионный"> Ретровирусы являются «прототипами» ретротранспозонов. Их цикл развития состоит из чередования РНК- и ДНК-стадий. Вирионный геном представлен РНК размером обычно 5-6 т.п.н. с короткими прямыми повторами. Когда ретровирус проникает в клетку хозяина, то с помощью кодируемой им обратной транскриптазы на матрице его РНК синтезируется ДНК-копия, но уже с ДКП (в англоязычной литературе LTR – long terminal repeats) длиной обычно 200-400 п.н. ДКП содержат двунуклеотидные инвертированные повторы на концах и еще ряд повторов на некотором расстоянии от концов, разнообразные регуляторные элементы (промоторы и терминаторы и энхансеры транскрипции). Наличием регуляторных элементов в ДКП обусловлены различные эффекты ретровирусов и ретротранспозонов, встроенных в хромосомы, на экспрессию соседних генов. Центральная часть ретровируса содержит 3 кодирующие рамки: gag – кодирует структурный белок вирионного капсида; pol – кодирует сложный полипептид, в котором слиты домены интегразы (ответственна за интеграцию ДНК-копии в хозяйский геном; интеграза соответствует транспозазе других подвижных элементов), обратной транскриптазы (ревертазы), РНКазы H (RNAse H удаляет РНК из гибрида ДНК-РНК) и протеазы (после транскрипции слитого полипептида протеаза «нарезает» его на отдельные функциональные полипептиды). Env – белки хвостового отростка вируса, которые ответственны за адсорбцию ретровируса на поверхности клетки-хозяина и, соответственно, его вирулентность. Большинство ретровирусов не содержат гена env и, следовательно, неинфекционны.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_22.jpg" alt=">В последние годы А. И. Ким и др. открыли, что мобильный элемент МДГ-4 (gypsy),"> В последние годы А. И. Ким и др. открыли, что мобильный элемент МДГ-4 (gypsy), содержит ген env и обладает инфекционными свойствами. Затем французские исследователи выявили у дрозофилы аналогичные элементы ZAM, Idefix и др., всего более 10. Таким образом, стало известно, что ретровирусы встречаются не только у позвоночных животных. Новые вирусы выделены в отдельную группу Errantiviruses – эндогенные ретровирусы беспозвоночных. У многих ретровирусов рамки считывания gag и pol перекрываются (а иногда они «сливаются» в общий транскрипт). Транспозоны из обеих групп встречаются среди всех групп живых организмов – от дрожжей до человека. Ретротранспозоны всегда делают в ДНК-мишени ДПП из 5 п.н.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_23.jpg" alt=">У ретроэлементов с ДКП транспозиция происходит по схеме, включающей РНК-интермедиат. С геномной ДНК"> У ретроэлементов с ДКП транспозиция происходит по схеме, включающей РНК-интермедиат. С геномной ДНК элемента транскрибируется РНК-копия, но уже с короткими концевыми повторами, с нее путем обратной транскрипции синтезируется ДНК-копия с ДКП, которая встраивается в новое место с помощью интегразы. Интеграция ретротранспозонов с ДКП происходит по механизму, идентичному с нерепликативной транспозицией у прокариот. Интегразы ретротранспозонов, несмотря на различие в названиях, полностью соответствуют транспозазам. Характерно, что структура каталитического центра интегразы ретровируса человеческого иммунодефицита HIV-1 очень сходна с таковой у транспозазы прокариотического элемента Is3. Сходная ситуация наблюдается между интегразой вируса птичьей саркомы ASV и транспозазами Is50 и Mu. Рекомбинация у ретроэлементов без концевых повторов менее изучена, но она также осуществляется через РНК-интермедиат.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_24.jpg" alt=">">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_25.jpg" alt=">Элементы без длинных концевых последовательностей: LINE и SINE "> Элементы без длинных концевых последовательностей: LINE и SINE Другая группа ретротранспозонов – элементы класса I.2 (ретропозоны). Их размер – тоже около 5-6 т.п.н., но на концах они не имеют повторов. На 3’-конце они содержат небольшую последовательность поли-A. Прямых повторов в ДНК-мишени они либо не образуют, либо делают не всегда, и, если делают, то нерегулярной длины. Ретротранспозоны класса II можно разделяют на 2 типа: LINE (long interspersed nuclear elements) и SINE (short interspersed nuclear elements) – длиной 200-300 п.н., которые не кодируют никаких белков и не способны к самостоятельному перемещению, а перемещаются, по-видимому, за счет элементов LINE.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_26.jpg" alt=">Структура LINE-элементов">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_27.jpg" alt=">LINE-элементы широко распространены как у беспозвоночных, так и у позвоночных. У млекопитающих LINE и"> LINE-элементы широко распространены как у беспозвоночных, так и у позвоночных. У млекопитающих LINE и SINE являются преобладающим типом мобильных элементов. Особенно много в геноме позвоночных так называемых Alu-повторов (SINE-элементы, получившие свое название от рестриктазы AluI), которые представлены сотнями тысяч копий на геном и, в случае генома человека, составляют 5% геномной ДНК. LINE-элементы состоят из 5’-нетранслируемой области, центральной части и 3’-нетранслируемой области. На конце 3’-нетранслируемой области находится короткая последовательность поли-A или поли-TAA. Центральная часть содержит гены обратной транскриптазы, РНКазы H и эндонуклеазы (EN), но не содержит ни гена интегразы, ни гена протеазы, так как механизм перемещения LINE-элементов резко отличается от механизма перемещения ретротранспозонов класса I.1.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_28.jpg" alt=">Механизм перемещения LINE- и SINE-элементов представлен на рисунке. В отличие от ретротранспозонов I типа,"> Механизм перемещения LINE- и SINE-элементов представлен на рисунке. В отличие от ретротранспозонов I типа, здесь реакцию интеграции в хозяйский геном инициируетет РНК-копия элемента. Эндонуклеаза делает ступенчатые ОНР в ДНК-мишени и РНК-копия прикрепляется к концу ДНК-мишени в точке разрыва. На матрице РНК-копии с помощью обратной транскриптазы строится ее ДНК-копия. Свободная группа 3’-OH в точке разрыва используется как праймер для обратной транскриптазы. Потом РНК-копия удаляется с помощью РНКазы H, клеточная репаративная система достраивает вторую цепь ДНК, которая оказывается интегрирированной в реципиентную ДНК. При этом на концах встроенного элемента могут возникать ДПП различной длины. SINE-элементы не способны к самостоятельной транспозиции и используют соответствующий аппарат LINE. Рассмотренный процесс принципиально отличается от других механизмов не только транспозиции, но и других типов рекомбинации вообще тем, что здесь не происходит расщепления ДНК на концах элемента и не происходит обмена цепями ДНК.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_29.jpg" alt=">Перемещение мобильного элемента LINE-типа">

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_30.jpg" alt=">Мобильные ретроэлементы имеют большое биологическое значение. Как и все мобильные элементы, они вызывают"> Мобильные ретроэлементы имеют большое биологическое значение. Как и все мобильные элементы, они вызывают хромосомные перестройки и инактивируют гены путем встраивания в экзоны генов. У дрозофилы на долю транспозиций приходится примерно половина спонтанных мутаций. Вероятно это имеет место и у других организмов. Мобильные элементы оказывают различные регуляторные эффекты. Например, если ретроэлемент встраивается в интрон, то он может влиять на ход транскрипции. Такая ситуация описана для гена white дрозофилы. У мутанта wa ретротранспозон встроился во второй интрон, что привело к возникновению целого набора альтернативных транскриптов. Соответственно, полной инактивации гена не произошло, и получились глаза абрикосового цвета. Другой пример – гомеозисная мутация antennapedia у дрозофилы. В этом случае мобильный элемент также встроился во второй интрон гена, и изменение экспрессии гена привело к тому, что вместо антенн получились дополнительные конечности. У позвоночных ретроэлементам приписывают важную роль в индукции канцерогенеза. Они могут встраиваться в хромосому перед протоонкогенами и за счет своих регуляторных элементов активировать протоонкогены, чем стимулируют неконтролируемое клеточное деление. Протоонкогены – это гены, которые работают только на ранних стадиях развития (в основном это гены регуляции клеточного цикла), а потом они должны замолчать.

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_31.jpg" alt=">У представителей рода Drosophila, D.melanogaster и D.virilis теломеры, в отличие от других организмов, формируются"> У представителей рода Drosophila, D.melanogaster и D.virilis теломеры, в отличие от других организмов, формируются путем последовательных транспозиций двух элементов LINE-типа: HeT-A и TART. Ретровирус HIV-1 вызывает у человека синдром иммунодефицита. Гомеозисная мутация antennapedia

Src="https://present5.com/presentacii-2/20171213%5C40718-mobil_n_e_element_ffm.ppt%5C40718-mobil_n_e_element_ffm_32.jpg" alt=">На долю подвижных элементов у эукариот приходится значительная часть генома: у дрозофилы – 20%,"> На долю подвижных элементов у эукариот приходится значительная часть генома: у дрозофилы – 20%, у человека – около половины. Перемещение мобильных элементов находится под жестким контролем как со стороны самих элементов, так, по-видимому, и со стороны организмов-хозяев. Частота транспозиции достаточно низка – в среднем 10-4-10-7 транспозиций на клетку за клеточную генерацию.

В середине 70-х г. XX в. открыты подвижные генетические элементы. Они представляют собой сегменты ДНК, способные к транспозиции (перемещению) в пределах одного либо разных геномов. По степени сложности строения различают три типа мигрирующих генетических элементов: IS-элементы (от англ, insertion sequence - вставочные последовательности), транспозоны (Tn-элементы) и некоторые бактериофаги, в частности фаг Мю.
Простейшими генетическими структурами, способными к транспозиции, являются IS-элементы. Размер их составляет в среднем 750-1500 пар нуклеотидов (п. н.). Они содержат только гены, обеспечивающие их собственное перемещение. В структуре IS-элементов различают центральную часть и ограничивающие (фланкирующие) концевые повторы. В центральной части расположены гены, кодирующие синтез белков, необходимых для транспозиции. Концевые участки представлены повторяющимися нуклеотидными последовательностями, длиной 8-40 п. н. Повторения имеют противоположную друг другу ориентацию и называются инвертированными (перевернутыми) повторами. Они служат отличительным признаком различных мигрирующих генетических элементов.
Структура концевых повторов определяет размеры дупликаций (удвоение) ДНК в местах внедрения IS-элементов. Так, IS 1-элемент, обнаруженный в составе хромосомы Е. coli-K12, состоит из 768 п. н., образующих на концах инвертированные повторы длиной по 30 п. н. каждый. Всякий IS-элемент имеет свою нуклеотидную последовательность и может в любой ориентации включаться в ДНК бактерий, плазмид и фагов, вызывая инактивацию отдельных структурных генов и, как следствие, мутации генома или нарушая регуляторные функции оперона. В бактериальной хромосоме может содержаться одновременно несколько копий одного и того же IS-элемента. Перемещение IS- элементов индуцирует разные виды хромосомных перестроек - дупликации, инверсии, делеции.
Транспозоны, или Tn-элементы - подвижные генетические элементы содержат гены фенотипических свойств бактерий и гены

собственной транспозиции. Они способны внедряться в разные участки хромосомы или во внехромосомные генетические структуры. Транспозоны отличаются от IS-элементов более сложной организацией, а некоторые содержат в своем составе IS-элементы.
Транспозоны разделяют на два класса: А и Б (рис. 10.4). Транспозоны класса А (Тп 5) в центральной части содержат структурные гены, которые детерминируют фенотипические свойства, например, устойчивость бактерий к антибиотикам, а гены транспозиции содержатся в составе концевых инвертированных повторов, которыми являются IS-элементы. У транспозонов класса Б (Тп 3) в центральной части содержатся не только гены фенотипических признаков, но и гены транспозиции. Концевые повторы их значительно короче и не могут выполнять функции транспозиции. Эти функции выполняют два гена центральной части. Различия между транспозонами класса А и класса Б состоят также в размерах образуемых дупликаций при внедрении их в плазмиды или хромосомы: первые образуют дупликации 9 нуклеотидных пар, вторые - только 5.

Рис. 10.4. Схема структуры транспозонов класса А и класса Б: ИП - инвертированные повторы; ГТ - гены транспозиций; ГФП - гены фенотипических признаков

Транспозоны имеют значительно большие размеры, чем IS- элементы и составляют в среднем 3 500-15 000 пар нуклеотидов. Так, общая протяженность транспозона Тп 5 составляет 5 800 п. н., из них по 1 500 п. н. приходится на инвертированные концевые повторы. Тп 5 кодирует пять белков. Из них один белок кодирует центральная часть и по два белка - концевые повторы. Транспозон Тп 5 детерминирует устойчивость к канамицину, неомицину и другим родственным антибиотикам.
Следствием перемещения транспозонов, как и IS-элементов, могут быть различные хромосомные перестройки: делеции, инверсии, транслокации, дупликации. Помимо них, перемещение транспозонов между двумя различными репликонами (двумя плазмидами, или плазмидой и хромосомой) может вызывать слияние этих репликонов с образованием коинтегратов. Последующая сайт-специфи- ческая рекомбинация приводит к разделению коинтеграта на два репликона с включением в каждый репликон по одной копии транс- позона. Регуляция транспозиции осуществляется собственными генами МГЭ и хромосомными генами бактерий-хозяев.
Умеренный фаг Мю, выделенный в 1963 г. из культуры холерного вибриона, также обладает свойствами МГЭ. Однако, в отличие от IS-элементов и транспозонов он не содержит на концах генома ни прямых, ни инвертированных нуклеотидных последовательностей. Концевые повторы фага Мю составляют фрагменты ДНК клетки-хозяина, в которой развивался фаг. ДНК клетки прикрепляется к геному фага при его размножении и теряется в ходе его интеграции в новый сайт. Уникальной способностью фага Мю является перенос генов бактерий в различные участки хромосомы или плазмиды клетки-реципиента. Фаг Мю осуществляет постоянную транспозицию в ходе всего литического цикла. Он не обладает специфичностью в отношении локуса хромосомы и может спонтанно внедряться в разные участки вдоль всей хромосомы, вызывая мутации хромосомных генов. За высокую активность индуцировать мутации он получил название Мю (от англ, mutator).
Несмотря на некоторые различия в структурной организации, общим свойством МГЭ является их способность внедряться во множество участков хромосомной или плазмидной ДНК, вызывая мутации и различные генные перестройки. МГЭ служат также специфическими сайтами внедрения плазмид в хромосомы. Через посредство МГЭ осуществляется рекомбинация между негомологичными ДНК. Временную область гомологии создают МГЭ,
включаясь в тот или иной участок хромосомной или плазмидной
ДНК.
Мигрирующие генетические элементы, индуцируя генные и хромосомные перестройки, вносят существенный вклад в перераспределение генетической информации, обеспечивают бактериям селективные преимущества в определенных условиях существования, оказывают существенное влияние на развитие и эволюцию микробных видов.