Разделение пигментов методом бумажной хроматографии. Разделение пигментов по Краусу

Хлорофилл — это пигмент, который придает листьям растений зелёный цвет. Хлорофилл обеспечивает растениям процесс фотосинтеза, процесс при котором с помощью солнечного света в растении происходят различные химические реакции, в том числе превращения углекислого газа из окружающего воздуха в различные органические вещества необходимые для жизнедеятельности растения. Именно в результате процесса фотосинтеза растения выделяют кислород , насыщая им воздух которым мы дышим!

Удивительно, но хлорофилл и гемоглобин (пигмент, окрашивающий кровь в красный цвет) имеют почти одинаковое строение! Молекулы хлорофилла и гемоглобина состоят из одного и того же комплекса и отличаются только центральным атомом. В хлорофилле это магний , а в гемоглобине — железо.

Формулы гемоглобина и хлорофилла

Применение хлорофилла

Хлорофилл используется уже достаточно длительное время в медицине. Хлорофилл обладает способностью выводить токсины из организма, его применяют при лечении язв и пролежней, для ускоренного заживления ран, а также используют как мягкое мочегонное средство и средство профилактики мочекаменной болезни. Обладая дезодорирующим эффектом, хлорофилл прекрасно справляется с неприятным запахом изо рта или пота. Недавние исследования японских ученых показали, что хлорофилл способен остановить образование и развитие раковых клеток. Правда, этот механизм ещё не изучен, но имеет отличные перспективы для создания средства лечения рака.

Хлорофилл может использоваться как чистый натуральный пищевой краситель , так и в составе пищевой добавки E140. Этот пищевая добавка совершенно безопасна и разрешена к использованию во всех странах мира. Хлорофилл придает продукту оливковый цвет и применяется в производстве мороженого, кремов, различных десертов, пудингов, в соусах типа майонеза.

Совсем необязательно искать этот полезный продукт в магазинах ведь хлорофилл можно получить самостоятельно в домашних условиях с помощью очень простого процесса.

Получение хлорофилла в домашних условиях

Получение хлорофилла достаточно простой процесс, который под силу любому. Для этого нам понадобятся любые свежие зелёные листья, больше всего хлорофилла содержится в шпинате, крапиве, брокколи и брюссельской капусте, но нам подойдут любые.

Немного измельчаем приготовленную зелень, помещаем в толстостенный сосуд (лучше стеклянный, но подойдет и эмалированная кастрюля) и заливаем небольшим количеством водно-спиртового раствора (для простоты можно использовать водку).

После этого помещаем стеклянный сосуд с ингредиентами в водяную баню. Через некоторое время жидкость начнет зеленеть — это выделяется хлорофилл. После того как получение хлорофилла закончено, осторожно вытащите листья. Они обесцветились, т.е. весь пигмент, придающий окраску листьям, выделился. Теперь выделенный хлорофилл можно использовать в быту, как было указано выше. Но будьте внимательны! Хлорофилл очень неустойчив на свету и воздухе и через некоторое время приобретет грязно-зелёный цвет. Поэтому использовать хлорофилл после получения следует как можно скорее!

Даже если вы не будете применять этот пигмент в хозяйстве, опыт по получению хлорофилла станет прекрасным наглядным уроком для ребёнка, ведь увидеть собственными глазами один раз лучше, чем рассматривать рисунки в учебнике биологии.

Знаете ли вы что?

Следы от травы на одежде можно легко оттереть спиртом или спиртосодержащими жидкостями

Выделение хлорофилла

На видео показано, как можно ещё произвести выделение хлорофилла в домашних условиях. Тут показан немного другой способ получения хлорофилла, отличающийся от вышеприведенного. В этом случае берутся листья, измельчаются, заливаются спиртовым раствором и растираются ступкой. В итоге получается раствор хлорофилла. Правда он будет находиться в спиртовом растворе, что несколько ограничивает применение такого хлорофилла.

Цель: ознакомить с порядком выполнения работы; сделать вывод о химических свойствах пигментов листа.

Теоретические сведения. Пигментная система хлоропласта представлена двумя типами пигментов: зелеными – хлорофиллами а и b и желтыми – каротиноидами. Основной функциональный пигмент – хлорофилл а , служит непосредственным донором энергии для фотосинтетических реакций, остальные пигменты лишь передают ему поглощенную энергию.

Ход работы:

Получение спиртового раствора (вытяжки) пигментов. Пигменты из растительной ткани извлекают полярными растворителями (этиловый спирт, ацетон), которые разрушают связь хлорофиллов и ксантофиллов с липопротеидами пластид и обеспечивают их экстрагирование. Сухие листья помещают в коническую колбу на 200 мл и ошпаривают кипятком, затем воду сливают. В колбу приливают 100 мл этилового спирта, закрывают ее корковой пробкой с обратным холодильником и ставят на баню с кипящей водой для экстрагирования пигментов. После пятиминутного кипячения содержимое колбы охлаждают и осторожно сливают в другую колбу. Экстракт используют в последующих опытах.

Разделение пигментов по Краусу. Метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине. Указанные растворители в одном сосуде не смешиваются, а образуют две фазы – верхнюю бензиновую, нижнюю спиртовую, благодаря чему компоненты смеси пигментов разделяются.

В пробирку наливают 2-3 мл спиртового экстракта пигментов, и 3-4 мл бензина. Содержимое пробирки встряхивают, закрыв ее пробкой или большим польцем, и отстаивают. По мере расслоения эмульсии бензиновый слой окрашивается в зеленый цвет из-за лучшей растворимости в нем хлорофилла. В бензин переходит и каротин, но его окраска максируется хлорофиллом. Ксантофилл остается в спиртовом слое золотисто-желтой окраски.

Если пигменты не разделяются, добавляют три- четыре капли воды и снова встряхивают. При избытке воды возможно помутнение нижнего слоя. В этом случае следует прилить немного этилового спирта и взболтать пробирку.

Зарисовывают картину распределения пигментов и делают выводы.

Омыление хлорофилла щелочью. Обрабатывая хлорофилл щелочью, можно вызвать омыление эфирных групп, т.е. отщепление остатков метилового спирта и фитола:

Образующаяся при этом соль хлорофиллиновой кислоты сохраняет зеленую окраску и оптические свойства хлорофилла, но отличается от него большей гидрофильностью.

В пробирку с 2-3 мл спиртового раствора пигментов приливают 1 мл 20%-ного раствора NaОН и взбалтывают. Пробирку ставят на кипящую водяную баню. Как только раствор закипит, пробирку вынимают и охлаждают, затем добавляют равный объем бензина и несколько капель воды. Содержимое пробирки резко встряхивают и отстаивают. В бензиновый слой переходят каротин и ксантофилл, а в спиртовой - натриевая соль хлорофиллиновой кислоты. Зарисовывают окраску слоев, указывая распределение пигментов.

Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла. Атом магния сравнительно слабо удерживается в порфириновом ядре хлорофилла и при осторожном воздействии сильных кислот легко замещается двумя протонами с образованием феофитина бурого цвета:

Если на феофитин действовать солями меди, цинка или ртути, то вместо двух протонов в ядро входит соответсвующий металл и продукты реакции окрашиваются в зеленый цвет. Однако полученная окраска несколько отличается от окраски хлорофилл:

Следовательно, цвет хлорофиллов обусловлен металлорганической связью в их молекулах. Обратное введение магния в феофитин сильно затруднено. В две пробирки берут по 2-3 мл спиртовой вытяжки пигментов и добавляют по одной – две капли 10%-ной раствора соляной кислоты. При взбалтывании зеленая окраска хлорофилла переходит в бурую, характерную для феофитина. Одну пробирку с феоситином оставляют для контроля, а во вторую вносят несколько кристаллов ацетата меди и нагревают раствор на водяной бане до кипения. По мере нагревания бурый цвет раствора меняется на зеленый в результате образования хлорофилло подобного производного меди.

Зарисовывают окраску феофитина и медьпроизводного хлорофилла.

Оборудование: Сухие или сырые листья, этиловый спирт, бензин, 20% -ный раствор NаОН, 10%-ный раствор соляной кислоты в капельнице, ацетат меди. Конические колбы с обратным холодильником, водяные бани, штативы с пробирками, пипетки на 1 мл, конические колбочки, цветные карандаши.

Литература: 1, с. 63-66

Контрольные вопросы:

1 Какава роль хлорофилла в процессе фотосинтеза?

2 Какава роль каратиноидов в процессе фотосинтеза?

3 Каков механизм приобразавания энергии света в химическую энергию?

Образование органических веществ из углекислого газа и воды за счет световой энергии происходит в зеленых пластидах - хлоропластах. Хлоропласты содержат ряд пигментов. Среди них два зеленых - хлорофилл a С55Н72О5N4Mg с синеватым оттенком, хлорофилл b С55Н70О6N4Mg с желтоватым оттенком и желтые - каротин C­40H56 и ксантофилл C­40H54(OH)2.
Чтобы изучить свойства этих пигментов, необходимо получить их в растворе. Они не растворяются в воде, но растворяются в спирте, ацетоне, бензине.
Цель работы. Ознакомиться с физико-химическими свойствами пигментов зеленого листа: растворимостью в различных растворителях; способностью хлорофилла к омылению; реакцией феофитинизации у хлорофилла под действием кислот. Получить спиртовую вытяжку из сухих листьев крапивы или свежих зеленых листьев различных культур.
Ход работы. Отвешивают 5 г свежих или 1 г сухих листьев, измельчают и помещают в ступку. При использовании свежих листьев в ступку прибавляют около 1 г СаСО3 и немного стеклянного или кварцевого песка и тщательно растирают листья. Затем добавляют спирт (около 10 мл) и продолжают растирание до получения темно-зеленой вытяжки.
С помощью специальной пипетки вытяжку переносят на сухой фильтр и фильтруют в сухую пробирку. Полученный фильтрат, имеющий темно-зеленый цвет, используют для анализа.
1. Разделение пигментов по Краусу. В сухую пробирку наливают небольшое количество (около 3 мл) полученной спиртовой вытяжки, прибавляют примерно полуторный объем бензина и несколько капель воды. Пробирку закрывают большим пальцем и несколько раз сильно встряхивают, а затем дают 2-3 мин постоять. После того как жидкость отстоится, в пробирке образуются два слоя: верхний зеленый слой (бензиновый) и нижний желтый слой (спиртовой). Если вода прибавлена в избытке, спиртовой слой мутнеет. В этом случае необходимо еще прибавить спирта и дать отстояться. Зарисуйте цветными карандашами слои в пробирках, где было получено разделение пигментов, обозначив, в каком растворителе растворяется тот или иной пигмент, или смесь пигментов. Сделайте выводы о различной растворимости пигментов в спирте и бензине. При этом нужно иметь в виду, что ксантофилл, будучи двухосновным спиртом, слабо растворим в бензине. Каротин, являясь непредельным углеводородом, лучше растворяется в бензине. Хлорофилл - сложный эфир - при разбавлении спирта водой перемещается в бензиновый слой.
2. Омыление хлорофилла щелочью. К 3- 4 мл спиртовой вытяжки добавляют 1-2 кусочка NaОН или КОН и взбалтывают. Происходит омыление хлорофилла. Затем приливают в пробирку равный объем бензина, несколько капель воды, сильно встряхивают и дают отстояться. В результате действия щелочи получаем следующее размещение слоев: вверху в бензине остается каротин, а внизу - ксантофилл, и к нему опускается вновь образовавшаяся натриевая или калиевая соль хлорофиллина. Она имеет такую же окраску, как и хлорофилл, но в отличие от него не растворяется в бензине.
Хлорофилл - это сложный эфир дикарбоновой кислоты хлорофиллина и двух спиртов метилового (СН3ОН) и фитола (С20Н39ОН).
Хлорофилл а
Хлорофилл b
При действии на хлорофилл щелочей эфирные связи омыляются, тогда в растворе получаются свободные спирты (метанол, фитол) и соль хлорофиллиновой кислоты.
Хлорофилл благодаря наличию фитола обладает хорошей растворимостью в бензине. При омылении его происходит отщепление спиртов - фитола и метанола. Оставшаяся часть молекулы - двухосновная кислота хлорофиллин - образует натриевую соль, которая, как и все соли, растворима в воде и нерастворима в бензине. В результате после омыления в бензине остается только высоколипофильный каротин.
Зеленый цвет хлорофилла связан с наличием в центральном ядре молекулы магния, который соединен с четырьмя пиррольными кольцами. Продукты омыления хлорофилла сохраняют зеленый цвет вследствие того, что центральное ядро в молекуле хлорофилла остается не разрушенным.
Зарисуйте цветными карандашами слои в пробирке и сделайте пояснения. Сформулируйте выводы о действии щелочей на хлорофилл и различной растворимости хлорофиллина в спирте и бензине.
3. Действие кислот на хлорофилл. Берут две пробирки со спиртовой вытяжкой пигментов и добавляют в обе пробирки по 3-4 капли 10 %-ного раствора соляной кислоты. Раствор становится бурым вследствие образования феофитина - продукта замещения магния в хлорофилле водородом.
Если в одну из пробирок с побуревшей от кислоты вытяжкой прибавить несколько кристаллов уксуснокислого цинка или меди и осторожно нагреть пробирку до кипения, при вскипании бурый цвет раствора сменится на ярко-зеленый. Происходит это потому, что атом цинка или меди становится на место водорода в молекуле феофитина, восстанавливая при этом его окраску. Напишите уравнение этой реакции. Сделайте зарисовки цветными карандашами.
Материалы и оборудование: свежие или сухие листья, этиловый спирт, бензин, NaOH или KOH, 10 %-ный раствор HCl, уксуснокислый цинк или медь, CaCO3, кварцевый песок или битое стекло, ступки с пестиком, воронки, штативы с пробирками, пипетки, спички, бумажные фильтры, цветные карандаши, пипетки для переноса вытяжки.

Лабораторная работа № 7.

Изучение свойств фотосинтетических пигментов

Цель работы: ознакомиться с методами экстракции пигментов и с их химическими свойствами.

Задание 1. Химические и оптические свойства пигментов листа

В процессе фотосинтеза высших растений участвуют две группы пигментов: зеленые – хлорофиллы а и b ; желтые – каротины и ксантофиллы. Мы познакомимся с методом выделения пигментов, разделения по методу Крауса, с основными химическими и оптическими свойствами пигментов. Работа состоит из отдельных этапов, которые выполняют в приведенной ниже последовательности.

1. Получение спиртового раствора пигментов

С этой целью можно использовать как сухие листья, так и свежий растительный материал. При работе с сухими листьями рекомендуется увлажнить их перед экстракцией пигментов. При работе с сырым материалом удобны листья герани, гороха, фасоли.

Для получения большого объема экстракта употребляют высушенные листья крапивы, которые помещают в коническую колбу вместимостью 200 мл и обваривают кипятком, затем воду сливают. В колбу приливают 100 мл этилового спирта, закрывают ее пробкой с обратным холодильником и ставят на 5 минут на баню с кипящей водой для экстрагирования пигментов. Затем содержимое колбы охлаждают и раствор осторожно декантацией сливают через воронку со складчатым бумажным фильтром. Отфильтрованный раствор используют в последующих опытах. Хранить растворы пигментов следует в темноте в холодильнике.

Ход работы : 1–2 г листьев герани поместить в фарфоровую ступку, добавить немного кварцевого песка (для лучшего измельчения растительных тканей) и щепотку мела (для создания нейтральной или слабощелочной реакции среды). Листья растереть до однородной массы, в которую добавить 10–15 мл 96%-ного этанола. После тщательного перемешивания гомогенат отфильтровать в пробирку через бумажный фильтр с белой лентой. Чтобы жидкость при выливании из ступки не стекала по стенке, приставить стеклянную палочку к носику ступки, смазанному снаружи вазелином. Ступку и пестик можно ополоснуть несколькими миллилитрами этанола, который надо сливать на этот же фильтр. Работа носит качественный характер; поэтому можно не добиваться полного переноса пигментов в раствор. Если первые порции фильтрата получились мутными, их снова надо профильтровать, не меняя фильтра. Полученный экстракт зеленого цвета пригоден для последующих опытов.

2. Разделение пигментов по методу Крауса

Метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине, которые при сливании не смешиваются, образуя два слоя: верхний – бензин; нижний – спирт. Эмпирическая формула хлорофилла a – С 55 Н 72 О 5 N 4 Mg, хлорофилла b – С 55 Н 70 О 6 N 4 Mg. Хлорофилл является сложным эфиром дикарбоновой кислоты хлорофиллина и двух спиртов – метанола и фитола. Фитол имеет длинную углеводородную цепочку (С20Н39), которая и определяет гидрофобность молекулы хлорофилла. Он лучше растворяется в гидрофобном растворителе – бензине. Каротин, будучи углеводородом (С 40 Н 56), также обладает гидрофобными свойствами и имеет большое сродство с бензином. Ксантофиллы – спирты (С40Н56О2), и поэтому они лучше растворяются в этаноле, чем в бензине.

Ход работы : в пробирку налить 2–3 мл спиртовой вытяжки пигментов и добавить 3–4 мл бензина Калоша (вместо бензина можно использовать петролейный эфир). Пробирку встряхнуть и дать отстояться содержимому. Происходит отслоение эмульсии. Сверху собирается бензин с перешедшими в него хлорофиллами, которые окрашивают данный слой в зеленый цвет. Каротин также находится в бензине, но его желтая окраска маскируется хлорофиллом. Нижний спиртовой слой содержит пигмент ксантофилл, который окрашен в желтый цвет.

Если разделение пигментов происходит недостаточно четко, в пробирку надо добавить 1–2 капли воды и снова сильно встряхнуть ее. Избытка воды следует избегать, так как может произойти помутнение раствора.

Результат работы зафиксировать в виде рисунка.

В заключение следует дать объяснение различной растворимости пигментов в спирте и бензине.

3. Омыление хлорофилла щёлочью

Сложные эфиры способны к реакции со щелочью (реакция омыления), при этом их молекула расщепляется на кислоту и спирт. Из пигментов листа омыляется только хлорофилл, от молекулы которого под влиянием щелочи отщепляются метанол и фитол:

Образующаяся при омылении натриевая соль хлорофиллиновой кислоты сохраняет зеленую окраску, но приобретает гидрофильные свойства, а значит, и большее сродство к спирту. Желтые пигменты при действии щелочи не изменяют своей химической природы.

Ход работы : в пробирку с 2–3 мл вытяжки пигментов добавить 1–2 капли 20%-ного раствора NaОН. Пробирку нагреть на водяной бане до закипания в ней раствора. После охлаждения добавить в пробирку 2–3 мл бензина и 2–3 капли воды (для лучшего разделения смеси). Затем содержимое пробирки сильно встряхнуть и дать отстояться. В пробирке должны присутствовать два слоя: нижний (спиртовый), окрашенный в зеленый цвет; верхний (бензиновый), окрашенный в желтый цвет. В спиртовом слое растворены натриевая соль хлорофиллиновой кислоты и ксантофиллы, окраска которых маскируется хлорофиллом. В бензиновом слое растворен каротин.

В заключение необходимо объяснить распределение окраски в спиртовом и бензиновом слоях.

4. Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла

Хлорофилл относится к Mg-порфиринам. Главной частью его молекулы является порфириновое ядро, состоящее из четырех пиррольных колец.

Их вершины с атомами азота направлены к центру порфиринового ядра и взаимодействуют с атомом магния, занимающим центральное положение. Магний в порфириновом ядре удерживается непрочно и при осторожном воздействии сильных кислот может быть замещен на два атома водорода.

Водородзамещенный хлорофилл называется феофитином и имеет бурый цвет:

Водород феофитина можно заменить снова металлом, если подействовать солями меди или цинка; при этом восстанавливается зеленая окраска пигмента. Следовательно, цвет хлорофилла зависит от наличия металлорганической связи в молекуле.

Процесс феофитинизации часто наблюдается в природе и свидетельствует об увеличении проницаемости живых мембран, а значит, о повреждении и гибели клеток.

Ход работы : в две пробирки налить по 2–3 мл спиртового раствора пигментов и прибавить по одной-две капли 10%-ной соляной кислоты. Зеленая окраска раствора переходит в бурую, так как образовался феофитин. Одну пробирку оставить для контроля, во вторую внести небольшой кристаллик уксуснокислой меди и нагреть раствор на водяной бане до кипения. Бурый цвет раствора изменится на зеленый, так как произошло образование хлорофиллпроизводного меди:

В конце работы зарисовать картину разделения пигментов после омыления хлорофилла.

В заключение необходимо объяснить изменение окраски.

Задание 2. Разделение фотосинтетических пигментов методом бумажной хроматографии

Разделение пигментов в настоящем задании основано на различной скорости их продвижения с растворителем. Это обусловлено различной адсорбцией пигментов на бумаге и частично – разной растворимостью в бензине и массой молекул. Эмпирическая формула хлорофилла a – С 55 Н 72 О 5 N 4 Mg, хлорофилла b – С 55 Н 70 О 6 N 4 Mg. Каротин (С 40 Н 56) имеет большое сродство с бензином. Ксантофиллы (С 40 Н 56 О 2) лучше растворяются в этаноле, чем в бензине.

Ход работы : приготовить ацетоновую (или спиртовую) вытяжку из свежих листьев любых растений. Навеска растительного материала должна составлять 2–3 г, объем ацетонового экстракта – 25 мл (100%-ный ацетон).

Из хроматографической бумаги вырезать полоску шириной 1,5–2,0 см, длиной 20 см. Держа полоску вертикально, опустить ее кончик на несколько секунд в вытяжку пигментов, налитую в бюксу. При кратковременном погружении вытяжка поднимается по бумаге на 1–1,5 см.

Затем бумагу высушить в токе воздуха и снова погрузить в раствор пигментов. Эту операцию повторить 5–7 раз, пока у верхней границы не образуется полоска ярко-зеленого цвета. После этого нижний конец хроматограммы опустить на несколько секунд в чистый ацетон, чтобы все пигменты поднялись на 1–1,5 см. Таким образом, на бумаге получают окрашенную зону в виде зеленой полоски, где сконцентрирована смесь пигментов, которую необходимо разделить.

Рис. 1. Вид хроматограммы с разделенными пигментами

Хорошо высушенную хроматограмму (до исчезновения запаха ацетона) поместить в строго вертикальном положении в камеру, на дне которой находится чашка Петри с растворителем (смесь бензин:бензол – 1:2), так, чтобы растворитель не касался зоны пигментов. Камеру герметично закрыть. Через 10–15 мин растворитель поднимется на 10–12 см. Смесь пигментов при этом разделится на отдельные компоненты в виде полос, расположенных в следующем порядке: первый снизу – хлорофилл b , над ним – хлорофилл a , затем – ксантофилл (рис. 1). Каротин продвигается вместе с фронтом растворителя быстрее других компонентов, и зона его на бумаге располагается выше всех других пигментов.

Полученную хроматограмму приклеить в тетрадь, обвести зоны пигментов карандашом и подписать.

Лабораторная работа 22

Химические свойства пигментов листа

Важнейшими компонентами фотосинтетического аппарата растений являются пигменты. Пигменты делятся на два класса: тетрапиррольные соединения (хлорофиллы и фикобилины ) и полиизопреноидные (каротиноиды ).

Фикобилины - это пигменты водорослей . У высших растений обнаружены хлорофилл «а», хлорофилл «b» и каротиноиды. Основным функциональным пигментом является хлорофилл «a», который обнаружен у всех фотосинтезирующих организмов (кроме бактерий). Он служит непосредственным донором энергии для фотосинтетических реакций. Остальные пигменты, лишь передают поглощенную энергию хлорофиллу «а».

DIV_ADBLOCK267">

Рис. 17 Структурные формулы каротиноидов и последовательность их превращений

При этом в циклических каротинах шестичленные кольца представлены двумя типами: β-иононовыми и α-иононовыми.

В фотосинтезирующих организмах эта группа желтых пигментов представлена ликопином, α-каротином, β-каротином и γ-каротином. У высших растений основным каротином является β-каротин.

Ксантофиллы - кислородсодержащие производные каротинов, включающие в себя лютеин (С40Н56О2), зеаксантин (С40Н56О4), виолаксантин (С40Н56О4), неоксантин (С40Н56О4) (рис. 17). Среди названных ксантофиллов преобладает лютеин, который по химической структype очень близок к α-каротину, но в отличие от него является двухатомным спиртом, т. е. в каждом ионовом кольце, один атом водорода замещен на гидроксильную группу.

Функции каротиноидов: 1) являются дополнительными пигментами; 2) защищают молекулы хлорофилла от фотоокисления; 3) играют роль в кислородном обмене при фотосинтезе.

Принцип метода: пигменты из растительной ткани извлекают полярными растворителями (этиловый спирт, ацетон), которые разрушают связь хлорофиллов и ксантофиллов с липопротеидами пластид и обеспечивают их полное экстрагирование. Неполярные растворители (петролейный эфир, гексан, бензин и др.) не нарушают связи этих пигментов с белками.

Цель работы: познакомиться с химическими свойствами пигментов листа.

Ход работы: 1. Получение спиртового раствора пигментов . Для получения вытяжки пигментов используют как сырой, так и сухой растительный материал. Высушенные листья предварительно обрабатывают горячей водой, чтобы облегчить последующее извлечение пигментов.

Свежие листья растений (1 г) мелко измельчить ножницами, поместить в ступку и растереть с небольшим количеством СаСО3. Постепенно в ступку приливать 2…3 мл этилового спирта и тщательно растереть навеску до получения однородной массы. Затем прилить еще 5…8 мл спирта, содержимое перемешать. Носик ступки снизу смазать вазелином и по стеклянной палочке содержимое ступки перенести на бумажный фильтр. Полученный фильтрат поместить в пробирку. Спиртовая вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.

2.Разделение пигментов по Краусу основано на различной растворимости пигментов в спирте и бензине. Эти растворители при сливании не смешиваются, а образуют две фазы верхнюю бензиновую и нижнюю спиртовую, благодаря чему и разделяются компоненты смеси пигментов.

В пробирку налить 2…3 мл спиртового экстракта пигментов и добавить 3…4 мл бензина. Содержимое пробирки сильно встряхнуть, предварительно закрыв ее пробкой или большим пальцем, и оставить отстояться. Для лучшего разделения добавить 1…2 капли воды.

По мере расслоения эмульсии верхний бензиновый слой будет окрашиваться в зеленый цвет, из-за лучшей растворимости в нем хлорофиллов. Кроме того, в бензин переходит каротин, но его окраска маскируется хлорофиллом. Ксантофилл остается в нижнем спиртовом слое, придавая ему золотисто-желтую окраску.

Если пигменты разделятся недостаточно четко, добавить 1…2 капли воды и снова встряхнуть. При избытке воды возможно помутнение нижнего слоя, тогда следует прилить немного этилового спирта и взболтать содержимое пробирки.

Зарисовать распределение пигментов в спирте и бензине, сделать выводы о различной их растворимости.

3. Омыление хлорофилла щелочью. При обработке хлорофилла щелочью происходит омыление эфирных групп, т. е. отщепление остатков метилового спирта и фитола (рис. 18). Образуется натриевая соль хлорофиллиновой кислоты, сохраняющая зеленую окраску и оптические свойства хлорофилла, но отличающаяся большей гидрофильностью, по сравнению с нативным пигментом.

Рис. 18 Омыление хлорофилла щелочью

В пробирку с 2…З мл спиртового раствора пигментов прилить 1 мл 20% раствора NaOH и взболтать. После смешивания экстракта со щелочью пробирку поместить в кипящую водяную баню, довести до кипения и охладить.

К охлажденному раствору прилить равный объем бензина и несколько капель воды для лучшего разделения смеси. Затем содержимое пробирки резко встряхнуть и дать ему отстояться.

В бензиновый слой перейдут каротин и ксантофилл, а в спиртовый - натриевая соль хлорофиллиновой кислоты.

Зарисовать окраску слоев, указав распределение пигментов3. Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла. Атом магния слабо удерживается в порфириновом ядре хлорофилла и при осторожном воздействии сильных кислот легко замещается двумя протонами, что приводит к образованию феофитина бурого цвета.

Если на феофитин подействовать солями меди, цинка или ртути, то вместо двух протонов в ядро входит соответствующий металл и вновь восстанавливается зеленая окраска. Однако она несколько отличается от окраски хлорофилла. Следовательно, цвет хлорофиллов зависит от металлоорганической связи в их молекуле.

В пробирку налить 2…3 мл спиртовой вытяжки пигментов и прибавить 1…2 капли 10% раствора соляной кислоты. В ходе реакции зеленый цвет меняется на бурый, при этом хлорофилл превращается в феофитин. Содержимое пробирки разлить в две пробирки.

Одну пробирку с феофитином оставить для контроля, а во вторую поместить несколько кристаллов уксуснокислой меди и нагреть раствор на водяной бане до кипения. После нагревания бурый цвет раствора меняется на зеленый в результате образования хлорофиллоподобного производного меди.

Зарисовать окраску феофитина и медьпроизводного хлорофилла.

https://pandia.ru/text/80/159/images/image005_49.gif" width="541" height="135 id=">

хлорофиллоподобное производное меди

Оборудование и материалы: 1) свежие листья растений; 2) этиловый спирт; 3) бензин; 4) 20% раствор NaOH; 5) 10% соляная кислота в капельнице; 6) 10% соляная кислота; 7) водяная баня; 8) штатив с пробирками; 9) пипетки на 1 мл или мерные пробирки; 10) воронки; 11) фильтровальная бумага; 12) ступка с пестиком; 13) стеклянные палочки; 14) ножницы.